Introducción
El botulismo es un proceso tóxico producido por una toxina preformada en el alimento, elaborada por Clostridium botulinum en la etapa de crecimiento bacteriano, que bloquea los impulsos nerviosos siendo capaz de crear, al menos, cuatro cuadros clínicos diferentes por bloqueo de la transmisión neuromuscular (Pérez-Pérez et al, 2002).
Existen cuatro formas de botulismo:
- Botulismo cursado por intoxicación alimentaria, que es la principal vía de intoxicación. Se produce a través de la ingestión de la toxina en alimentos mal preparados o conservados inapropiadamente. (Se verá con más detalle en el apartado correspondiente)
- Botulismo de las heridas, por producción de la toxina in vivo en heridas contaminadas, pudiendo provocar un cuadro neurodegenerativo tras un periodo de incubación de 10 días. .
- El botulismo infantil se debe a la ingestión de la espora y posterior producción in vivo de la toxina en el intestino del lactante.
- Botulismo indeterminado, conocido también por botulismo infeccioso entérico del adulto. Ocurre de manera similar al botulismo infantil, donde la toxina es producida en el intestino colonizado por C.botulinum, encontrándose únicamente esporas en el alimento sospechoso.
Los primeros casos de botulismo se remontan al siglo IX, en el Oriente Medio, asociado con algunos tipos de embutidos. Aunque no fue hasta 1896 cuando se descubrió y aisló la bacteria causante de la enfermedad así como su toxina. En 1970 se aisló el último de los 8 serotipos de toxina botulínica que se conocen en la actualidad.
En Europa, el 40% de los brotes de botulismo se producen en el hogar, debido a un mal cocinado o conservación de los alimentos, por lo que se recomienda seguir unas pautas de higiene y preparación adecuadas a fin de evitar el riesgo derivado (Elika, 2013).
Vectores alimentarios
C.botulinum es un microorganismo muy distribuido en el suelo. Sus esporas pueden sobrevivir en ambientes adversos como las capas más profundas del suelo, la arena de mar, lechos marinos o lodos de ríos y lagos. Entre los alimentos implicados destacan las carnes y productos cárnicos (contaminados a partir del suelo o heces, pudiendo tener el bacilo de forma natural en piel o intestino), sometidos a proceso de conservación, en productos como jamón ahumado, embutidos o patés entre otros. En pescados crudos (presencia en el intestino o contaminados en la captura) conservados en salados o ahumados deficientes. También en conservas vegetales con bajo grado de acidez, como judías o espinacas, ya que como se ha indicado están expuestos a través de suelos contaminados.

Características del microorganismo.
C. botulinum es un bacilo Gram positivo de la familia Bacillaceae, anaerobio extricto, sin cápsula y formador de esporas resistentes, difíciles de inactivar. La espora no tiene únicamente el propósito de proteger frente a condiciones ambientales adversas, si no que proporciona un medio próspero para que las bacterias liberen su neurotoxina cuando comience a germinar.
Bacilos rectos o ligeramente curvados de 2-10 x 0,5-2 micras. Sus esporas son ovales y deforman la célula cuando se producen.
Son móviles mediante flagelos perítricos con 4 estructuras antigénicas: somática, flagelar, esporas y endotoxinas.
Crecen a temperaturas entre 15-69ºC, aunque el rango de crecimiento óptimo es 25-35ºC.
Toleran pH comprendidos entre 4.6 y 8
No crecen a concentraciones de sal superiores al 10%, o un aw < 0.935.
En cuanto a su metabolismo, la mayor parte de las cepas fermentan carbohidratos.
Son productoras de gas, ácido sulfhídrico y acetil metil carbinol.
Las cepas de C. botulinum se clasifican en cuatro grupos en función de sus propiedades bioquímicas y su capacidad proteolítica (grupos I-IV) (AECOSAN, 2014)
- I (proteolítico, toxinas A, B, F)
- II (no proteolítico, toxinas B, E, F)
- III (toxinas C, D)
- IV (toxina G)
Toxina
Se trata de un veneno muy potente (10-10 g/kg mataría a un ratón). Existen al menos 7 serotipos de toxina botulínica, designadas con las letras A a G (el serovar C contiene dos componentes C1 y C2). Los tipos A, B, E, F, G son los únicos que afectan al hombre. La toxina A posee mayor afinidad por el tejido nervioso. Los tipos C, D y E producen enfermedades en otros mamíferos, aves y peces. Los genes codificantes de estas toxinas se encuentran en diferente localización dependiendo del serotipo y su síntesis es ejercida por un fago específico.
Todas las neurotoxinas se producen en la fase de crecimiento y se liberan durante la lisis bacteriana, producida de manera espontánea, bajo la influencia de autolisinas producidas por la propia cepa de C. botulinum (Pérez-Pérez et al, 2002).
Están formadas como una única cadena polipeptídica simple de escasa actividad, que posteriormente sufre una modificación debido a la acción de proteasas, dando lugar a una cadena pesada (H) y una ligera (L) de aproximadamente 100 y 50 kDa respectivamente, unidas por enlace disulfuro. La cadena ligera, fracción realmente tóxica, posee actividad metaloendopeptidasa, se activa tras la reducción del puente disulfuro. La cadena pesada contiene dos dominios: uno es el responsable del proceso de translocación de membrana de la cadena ligera en el citosol de la neurona; el otro es responsable de la unión neuroespecífica de la molécula. Estas moléculas se absorben en diferentes áreas del intestino. (Cameán et al, 2012)

Mecanismo de acción
En alimentación, la intoxicación se produce al ingerir la toxina preformada. Se absorbe a nivel intestinal por endocitosis. La toxina es transportada vía linfática o sanguínea hasta las terminaciones nerviosas del sistema nervioso periférico, bloqueando la liberación del neurotransmisor acetilcolina.
La toxina no interfiere en la síntesis y degradación de acetilcolina, si no que interviene produciendo la lisis del complejo de proteínas SNARE, encargadas del mecanismo de exocitosis por parte del nervio ( cada cadena L de los diferentes eserotipos dividen el complejo SNARE en un sitio específico) , lo que impide la transmisión del impulso nervioso causando una parálisis flácida de los músculos esqueléticos y fallo parasimpático (AECOSAN, 2016), con una tasa de mortalidad del orden del 10%.

Mecanismo de inhibición del neurotransmisor acetilcolina (versión modificada de NOTIMEX)
Sintomatología
Las neurotoxina botulínica tiene un periodo de incubación generalmente de 18-36 horas tras la ingestión del alimento (puede presentarse entre las 4 horas posteriores hasta un máximo de 8 días), provocando parálisis flácida, pudiendo producir insuficiencia respiratoria y del habla.
Inicialmente se muestra un cuadro de fatiga intensa, debilidad y vértigo, seguido de visión borrosa, sequedad de boca y dificultad para tragar y hablar. Pueden darse otros síntomas como vómitos o diarrea, así como inflamación abdominal.
El bloqueo de la acetilcolina produce la parálisis muscular, involucrando a los músculos del sistema respiratorio cardíaco, pudiendo causar la muerte.
El botulismo infantil se produce en niños de entre 1 a 52 semanas de edad al ingerir el alimento contaminado (los principales vectores son la miel y el jarabe de maíz, si bien se han detectado en preparados para lactantes, cereales, verduras, infusiones, etc.). Las bacterias llegan al tracto intestinal y, debido a la inmadurez de la flora, las esporas botulínicas germinan (únicamente por los serotipos A y B) y liberan la toxina en el colon, donde es absorbida pasando a sangre y uniéndose a los nervios periféricos, impidiendo la liberación de la acetilcolina.
El primer síntoma es el estreñimiento, posteriormente los síntomas observados incluyen constipación, letargo y falta de apetito, falta de expresión en el rostro, dificultad para tragar. En casos severos, produce parálisis pudiendo llegar a causar la muerte del lactante.
Profilaxis
Deberán incorporarse buenas prácticas de higiene y fabricación de productos alimentarios. También la verificación de cada una de las etapas del proceso mediante la implantación de un correcto APPCC, estudiando en qué procesos podría desarrollarse C. botulinum, controlando la integridad de los envases, y respetando los procesos de enfriamiento, almacenamiento y transporte en condiciones higiénicas.
Se puede controlar el desarrollo de la toxina de C.botulinum a través de una limpieza adecuada del producto, utilizando alimentos frescos y minimizando la contaminación de productos cárnicos durante el sacrificio. La modificación de los factores de crecimiento como el pH (se inhibe la producción de la toxina a pH iguales o inferiores a 4.6), actividad de agua (valores de aw por debajo de 0.93 impiden el crecimiento del microorganismo), temperatura (tratamientos a pH ácidos y temperaturas de 121ºC durante 3 minutos inactivan las esporas de C. botulinum, las toxinas son relativamente sensibles al calor y se inactivan a 80ºC 10 minutos. Temperaturas de refrigeración a 4ºC inhiben la producción de las toxinas). También mediante el uso de conservantes químicos que inhiban el crecimiento (vg: nitritos en carne).
La existencia de gas o hinchamiento en conservas puede ser indicativo de la acción proteolítica de las toxinas botulínicas, por lo que se recomienda desechar envases abollados, rotos o inflados.
Se deben extremar las precauciones al elaborar conservas caseras, esterilizando los productos preparados en ollas a presión durante 30 minutos, refrigerándolos y almacenándolos en condiciones óptimas.
Métodos de detección
A pesar de su cuadro clínico claro, la forma más efectiva y directa de diagnóstico se realiza en laboratorio mediante la detección del microorganismo o sus neurotoxinas, si bien no es un procedimiento adecuado para laboratorios de análisis rutinarios ya que, por ser una sustancia extremadamente tóxica, deberán extremarse las medidas de seguridad.
Se confirma mediante el aislamiento microbiano a partir del alimento sospechoso y heces (en ocasiones la sintomatología del paciente requiere el uso de enemas para extraer una muestra) o vómitos de la persona infectada. Por otro lado puede realizarse un análisis para conocer el serotipo de C. botulinum a través del estudio de sus toxinas en muestras alimentarias, heces o en suero.
- En el estudio de muestras alimentarias se debe utilizar protección especial por parte del analista, así como material estéril y desinfectantes como alcohol yodado para la limpieza de la lata. Como paso previo a la apertura del envase se observará si existe abombamiento, volviendo a realizar un análisis visual una vez abierto (presencia de burbujas, color, etc.). Se extrae una alícuota y se mezcla a partes iguales con tampón fosfato, homogeneizando con la ayuda de un Stomacher. Finalmente se centrifuga a 3500rpm durante 30 minutos a 4ºC, separando sobrenadante (donde se detecta la toxina) del sedimento (contiene las células vegetativas o esporas).
En el análisis del sedimento se extraen alícuotas e inoculan en caldo de carne cocida, poniéndolas en anaerobiosis a diferentes condiciones de incubación (una batería a temperatura ambiente, otra calentando a baño maría a 60ºC, la última calentando a 80ºC). Las diferentes condiciones de temperatura sirven para seleccionar las esporas por su termo resistencia. Finalmente se incuban en anaerobiosis durante 7 días a 30ºC. El caldo contiene sustancias reductoras que favorecen el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. Transcurrido ese tiempo se siembran en placa en anaerobiosis a 30ºC 3 días. Las colonias de C. botulinum crecen en agar sangre mostrando un patrón hemolítico característico, o agar yema de huevo donde, debido a su actividad lipolítica, presentan un precipitado amarillento. Finamente se realizan pruebas específicas sobre las colonias sospechosas (tinción Gram, análisis metabólico frente a glucosa (+), maltosa (+) y lactosa (-), capacidad sulfito-reductora, pruebas inmunoenzimáticas, etc.), aunque raramente se aísla el microorganismo el cuadros clínicos de botulismo.
En el sobrenadante se dividen tres alícuotas: la primera porción se calienta a 100ºC 5 minutos, con el fin de eliminar la toxina. La segunda se diluye 1:5 en tampón fosfato. La tercera se diluye a partes iguales con tripsina al 1% en tampón fosfato. La tripsina actúa activando las toxinas de los serovares no proteolíticos. Finalmente las 3 preparaciones se estudian mediante un bioensayo en ratones.
- El diagnóstico diferencial de la toxina se realiza en ratones, utilizando antisueros específicos para cada tipo de toxina. Se trata de un ensayo específico y sensible donde se obtienen resultados antes de 72 horas (el cultivo específico por métodos clásicos en placa tarda alrededor de 7-10 días). El procedimiento consiste en inocular muestras de heces (principalmente) o suero infectado, así como los extractos del sobrenadante vistos en el apartado anterior en distintos lotes de ratones a los que se les suministra antitoxina y se observa la sintomatología y supervivencia.
- Se están desarrollando pruebas alternativas al bioensayo sobre ratones, como el estudio sobre cultivos celulares o inmunoensayos específicos como ELISA, si bien su sensibilidad y fiabilidad todavía no es equiparable. Actualmente puede caracterizarse el serovar de C. botulinum a partir del estudio por amplificación genómica de los genes codificantes de las neurotoxinas.
Tratamiento
La incidencia de esta enfermedad es baja, pero es de gran impacto debido a su alta tasa de mortalidad en caso de no ser tratada apropiadamente y a tiempo. La recuperación de la intoxicación botulínica generalmente lleva de semanas a meses, dependiendo de la gravedad, pudiendo quedar secuelas de parálisis donde no se podrá recuperar la funcionalidad perdida.
Si la ingestión es reciente podrá realizarse un lavado gástrico y forzar el vómito. Si no hay obstrucción intestinal se procederá a suministrar purgantes y enemas para eliminar la toxina del intestino.
Deberá suministrarse ventilación mecánica en los casos más graves, pudiendo ser necesario administrar líquidos intravenosos si persiste la dificultad de deglución. La administración de antitoxina trivalente de caballo (Tornese et al. 2008) es recomendada para los serotipos A, B y E donde, suministrada a tiempo, puede detener la progresión de la enfermedad, neutralizando la toxina circulante. No es recomendable el uso de antibióticos, pues no está demostrada su eficacia en cuadros de botulismo.
Bibliografía
AECOSAN. Intoxicación botulínica en Cataluña. Disponible en: http://www.aecosan.msssi.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/ampliacion/alubia_blanca.htm
Camean, AM. Et al. Contaminantes biológicos: Toxicología alimentaria (Monografía). Ed. Díaz Santos (2012)
Elergonomista. Clostridium Botulinum. Disponible en: http://www.elergonomista.com/microbiologia/botuli.htm
ELIKA web. Disponible en: http://www.elika.net
Eroski Consumer, Intoxicación por botulismo. Disponible en: http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/ciencia-y-tecnologia/2007/01/10/26323.php
Food-Info. Clostridium Botulinum. Disponible en: http://www.food-info.net/es/bact/clbot.htm
Medios de cultivo bacterianos. Disponible en: http://www.britanialab.com.
Pascual Anderson, MR. Enfermedades de origen alimentario: su prevención. Ediciones Díaz Santos S.A., (2005)
Pérez-Pérez, H et al. Botulismo y toxina botulínica. Revista de toxicología Vol 20 (2003)
Solomon, HM. Lilly T. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 17. Clostridium botulinum. Disponible en: https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm070879.htm
Tornese, M et al. Epidemiología y factores de riesgo asociados al botulismo de los alimentos y al botulismo infantil: ¿Dónde y cuándo? Rev Chil Infect Vol 25, Num 1 (2008)
Valdezate, S et al. Descripción de los serotipos responsables de los casos de botulismo en humanos en España, 2010-2011. Boletin Epidemiológico Semanal Vol. 19, Núm. 18 (2011)
Yuste J. et al. Métodos rápidos y automatización en microbiología alimentaria. Alimentaria, (2007)