SALMONELLA

Introducción

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos Gram -, anaerobios facultativos flagelados que no desarrollan cápsula[1] ni esporas. Está considerado como un bacilo patógeno primario, como Shigella, Yersinia y ciertas cepas de E. coli. Existen alrededor de 2500 serotipos diferentes, clasificados en base a los antígenos O y H.

Forman colonias típicas sobre medios de cultivo sólidos y poseen características bioquímicas y serológicas definidas (Pascual y Calderón, 1999)

Taxonomía

La clasificación de esta especie ha sido complicada, viéndose modificada tras el aporte de estudios moleculares de DNA.

Clásicamente se distinguían tres especies patógenas S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis, que a su vez se subdividían en más de 2000 serotipos en base a los antígenos flagelares H (proteico) y somáticos O (polisacárido). S. typhi posee además un antígeno de virulencia (Vi).

En la actualidad, se han reagrupado en función de su patogenicidad en dos especies: S. enterica y S. bongori, siendo esta última no patógena para el ser humano.

La especie S. entérica, a su vez se divide en seis subespecies:

• I enterica.
• II salamae.
• IIIa arizonae.
• IIIb diarizonae.
• IV houtenae.
• V S. bongori, ya incluida en una especie distinta.
• VI indica.

Y éstas a su vez, en diferentes serotipos. Por ejemplo  S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I), se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. con diferentes serotipos.

Con el fin de simplificar esta terminología, se pueden agrupar en tres divisiones ecológicas:

• Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C.
• Salmonella spp. adaptadas a animales, que pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S. dublin, S. Gallinarum y S. cholerae-suis.
• Salmonella spp. sin adaptación específica, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, causantes de la mayor parte de las toxiinfecciones.

En la actualidad, de acuerdo con las normas internacionales y al Reglamento Sanitario, la sola presencia de Salmonella en un alimento es causa de rechazo del producto, ya que esta toxiinfección es considerada una de las causas más importantes de enfermedades transmitidas por alimentos responsables de la mitad de todas las infecciones en humanos (CDC, 2013). Existen estudios que demuestran que una baja concentración de Salmonella (100 gérmenes/g) puede causar la enfermedad.

Características

Su morfología es de bacilos gruesos y cortos, con un agrupamiento celular en pares u ocasionalmente en cadenas cortas.  

Su tamaño es de 0.6 a 0.7 micras de grosor y 2-3 micras de largo.

Crece a temperaturas comprendías entre 15 y 47ºC con un intervalo de pH entre 4 y 9.1.

Resisten a temperaturas de refrigeración y congelación, así como a la desecación.

Como enterobacterias, poseen algunas características generales de este grupo: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasas negativo y suelen ser móviles. Al igual que la Escherichia, son bacterias que se multiplican en el intestino.

No fermentan lactosa. Reducen nitratos a nitritos. Son citocromo-oxidasa negativos. Producen ácido sulfhídrico (S typhi es la única que no produce gas en la fermentación de los azúcares).

Salmonella spp. presenta escasa especificidad por el hospedador, ya que se adapta muy bien a los animales y personas. Cuando llega a un alimento es capaz de multiplicarse a gran velocidad (duplicando su número cada 15 minutos a temperaturas superiores a 20ºC).

Estructura antigénica

• Somático O,  lipopolisacárido de la pared celular, es termoestable. Es la base de la clasificación en subgrupos.

• Flagelar H, de carácter proteico, secuencia de aminoácidos que forma la  flagelina, es termolábil. Es la base de la clasificación de especies.

• Envoltura Vi, termolábil, responsable de la virulencia de varias especies patogénicas en S. typhi. Impide la aglutinación de sueros anti O.

Metabolitos

• Endotoxina: toxina presente en la pared celular que sólo se libera tras la lisis de la misma. Produce fiebre, diarrea y vómitos.

• Enterotoxina: sustancia (proteica) producida por la bacteria que afecta al tracto digestivo.
• Citotoxina: Inhibe la síntesis proteica.

Aislamiento e identificación

Los métodos para la detección de Salmonella en alimentos están basados fundamentalmente en que su presencia suele ser menor que la de la flora acompañante. En el laboratorio se consideran todos estos factores permitiendo recuperarla mediante diferentes etapas (Pascual y Calderón, 1999):

Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo

Etapa que consiste en la revivificación de las Salmonellas al diluir la muestra alimentaria en agua de peptona tamponada (APT) que mantiene unas condiciones constantes de pH y nutrientes permitiendo unas condiciones adecuadas para el desarrollo de Salmonella.

Para ello se pesan 25g de alimento e introducen en 225mL de una solución de APT. Se mezcla e incuba a 37ºC durante 16-20h. Para el análisis de superficies, utilizando por ejemplo esponjas abrasivas, se incuba en 125mL de APT.

Enriquecimiento en medio líquido selectivo

Seguidamente una alícuota del proceso  anterior se utiliza para sembrar en  un  medio selectivo (dilución 1:10) que  estimula  y  favorece  el  crecimiento  de   Salmonella inhibiendo  la  flora  acompañante, o bien   realizarse  un  enriquecimiento  sobre  la  muestra alimentaria diluida  en  APT  al  que  se   adiciona   IRIS  Salmonella   como  suplemento   selectivo evitando el primer paso.

Como medios líquidos selectivos para Salmonella se pueden utilizar:

• Caldo selenito- cistina. El selenito  inhibe  gran  parte  de  la  flora intestinal competitiva  y  la  cistina  favorece  el crecimiento de Salmonella, incubando a 37ºC 18-24h.

• Caldo Rappaport- Vassiliadis. El verde de malaquita inhibe la flora acompañante. Los fosfatos mantienen constate el valor de pH durante la incubación y el cloruro magnésico que incrementa la presión osmótica, favorece el desarrollo  de Salmonella. La recuperación óptima se obtiene incubando a 42ºC 18-24h. La aparición de turbidez en el tubo denota la presencia de Salmonella.

• Caldo tetrationato-bilis-verde  brillante  (Müller  Kauffmann).  El  tetrationato  inhibe  el  crecimiento  de coliformes y otras bacterias intestinales. La bilis favorece el crecimiento de Salmonella e impide el desarrollo de la flora competitiva. El verde brillante inhibe las bacterias gram + y el carbonato mantiene constante el pH. Se obtiene una recuperación más favorable a 42ºC 18-24h.

Aislamiento diferencial sobre medio sólido selectivo

En esta etapa se estimula el crecimiento selectivo de Salmonella, permitiendo, a través de los diferentes medios, colonias con aspecto característico. Se recomienda hacer un cultivo en placa por duplicado incubando a 37ºC 24-48h..

• Agar verde brillante-rojo fenol (BGA). Colonias de color rosado, transparentes, rodeadas por un halo rojo por no tener metabolismo fermentativo de lactosa.

• Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD). Colonias rojas por la fermentación de la xilosa y descarboxilación de la lisina, acompañada de un descenso de pH, cuyo interior se encuentra pigmentado de negro debido a la producción de SH₂. 

• Agar Salmonella-Shigella (SS). La preencia de hierro y tiosulfato permiten la formaciñon de FeS, lo que conlleva al ennegrecimiento de las colonias. El verde brillante, sales biliares y citrato inhiben la flora acompañante. La presencia de un halo rojizo alrededor de las colonias es indicativo de coliformes por su carácter fermentativo  frente a la lactosa.

• -Agar Hektoen (HE). Colonias  verde- azuladas,  pudiendo  tener  el  centro  negro.  La  presencia de  sales biliares inhibe la flora competitiva. Este medio posee dos indicadores (azul de bromotimol y fuchina ácida) que permiten la diferenciación de las bacterias lactosa-positiva y lactosa-negativa. El tiosulfato sódico y citrato de hierro permiten la producción de sulfhídrico.

• Agar sulfito bismuto (SB). Colonias negras (SH₂ +) con borde claro y rodeadas de un precipitado negro brillante, por la reducción del bismuto. En ocasiones las colonias pueden ser verdes grises o marrones.

• Agar manitol- lisina- cristal  violeta-  verde  brillante  ( MLCB).  El  carácter  fermentativo  sobre  manitol desciende el pH, iniciando la descarboxilación de la lisina, apareciendo coloración negra que, unido a la producción de sulfhídrico muestra colonias grandes de color negro.

• Agar  cromogénico :  Medio  utilizado  para  la  diferenciación  selectiva  de  microorganismos  utilizando sustratos cromogénicos que producen coloración característica para cada microorganismo.
• Agar Compass Salmonella: Sirve para la detección específica de todas las cepas de Salmonella produciendo colonias rojo-magenta tras su incubación a 37ºC 24h.
• Agar IRIS Salmonella: Se procede del mismo modo que para Compass Salmonella, obteniendo colonias magenta.

Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas

Sobre las colonias sospechosas de la siembra en placa, se aíslan, como mínimo dos colonias con aspecto característico de Salmonella para realizarles pruebas bioquímicas.

• En tinción Gram se mostrarán bacilos rosáceos, agrupados en forma de cadena.

• Oxidasa (-): Determina la presencia de citocromo c oxidasa. Para ello se hace reaccionar una suspensión líquida de Salmonella en un disco impregnado con un reactivo (TMFD) virando a granate o azul oscuro al oxidarse (+), o bien a incoloro al reducirse (-).  Las enterobacterias son oxidasa negativas.

• Producción de ureasa: (-) Se realiza una siembra en tubos que contengan caldo urea e incubar a 37ºC a baño maría durante 2 h.  Los microorganismos ureasa positivo crecen en el medio haciendo virar el indicador a rojo.

• Descarboxilacion de la lisina: (+) Se siembra en caldo lisina a 37ºC 48h. Las bacterias que descarboxilan la lisina, producen cadaverina, se reconocen por la presencia de un color rojo-púrpura debido al aumento de pH.

• Siembra en IMVIC. Utilizada para la identificación de enterobacterias, consiste en realizar cuatro pruebas bioquímicas (Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato) obteniendo resultados positivos o negativos según coloración, incubando a 37ºC 48h. (figura 7)     
• Indol: determina si la bacteria posee triptofanasa, que hidroliza el triptófano del medio  en  indol y alanina. El indol se detecta empleando el reactivo de Kovacs. Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado indol.
• Rojo de metilo: Detecta la fermentación ácido-mixta a partir de algún carbohidrato fermentable (vg: glucosa)  que descienden el pH del medio hasta 4-5, mostrándose al añadir  rojo de metilo al cultivo. Una reacción positiva se denota con la coloración del tubo al rojo.
• Voges-Proskauer: Detecta la fermentación butanodiólica, produciendo una gran cantidad de butanodiol. Mediante el uso de alfa-naftol y KOH al 40%, se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo, y éste reacciona con compuestos que contengan guanidina, como la arginina, obteniendo una coloración roja.
• Citrato: En esta última prueba se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. Empleado el caldo Koser (con citrato) se detecta turbidez. También se puede utilizar agar citraro de  Simmons: medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato (viraje a azul)

El resultado de esta prueba para Salmonella spp es -+-+ (siendo variable el resultado para citrato dependiendo del serovar analizado).

• Medio Kligler: Utilizado para la diferenciación de enterobacterias en base a su metabolismo fermentativo y la producción de sulfhídrico. Detecta la producción de ácido, gas y SH₂. (figura 7) Para ello se realiza una siembra por picadura y en superficie en el tubo e incuba a 37ºC 24h. El medio contiene lactosa y glucosa como carbohidratos fermentables, rojo de fenol como indicador de pH, tiosulfato de sodio, citrato de hierro y amonio, que reaccionan con el sulfhídrico produciendo coloración negra en el tubo. Transcurrido el periodo de incubación se aprecia el fondo del tubo amarillo y la superficie rosa por la fermentación de glucosa, presencia de burbujas por la producción de gas y el ennegrecimiento del medio por la síntesis de SH₂, lo que ayuda a identificar el serotipo bacteriano. Por ejemplo S. typhimurium no produce gas pero si sulfhídrico, al contrario que S. enteritidis.

• Al sembrar en tubos de agar hierro triple azúcar (TSI) en superficie y por picadura y tras el periodo de incubación a 37ºC 24h se muestra una coloración roja en superficie y amarilla en el fondo, indicando que el microorganismo sólo fermenta glucosa. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, denota la producción de gas y el ennegrecimiento del medio que es productor de SH₂.

• Medio agar lisina hierro(LIA). Se realiza una siembra similar a la realizada en medio TSI obteniendo tras el periodo de incubación de 48 h a 37ºC el fondo del tubo de color rojo (glucosa +) con ennegrecimiento del medio (SH₂ +).

Pruebas rápidas para la detección de Salmonella

Puesto que realizar todo el análisis para la identificación de Salmonella puede alargarse hasta los 7 días, se han optimizado nuevos métodos aplicados en laboratorio que permiten detectarla más rápidamente.

• Sistemas miniaturizados y kits comerciales: Sistemas rápidos basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y su detección por medio de diversos indicadores, como por ejemplo la galería API, que consta de 21 test bioquímicos dispuestos en pocillos en los que se inocula una solución de las colonias sospechosas. Tras 18-24h a 37ºC se anotan los resultados positivos y negativos obteniendo un perfil numérico que se analiza mediante programas informáticos obteniendo la especie analizada con un intervalo de confianza. (vg: 4004550 S. typhi, 4404112 S. gallinarum).

• Test ELISA: Se trata de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en la que se detecta un antígeno mediante un anticuerpo asociado a una enzima, capaz de generar un producto detectable, permitiendo identificar los anticuerpos de Salmonella.
• También se pueden realizar métodos  como la aglutinación en placa (AP), microaglutinación (MA) inmunofluorescencia (IF), entre otras, que permiten detectar anticuerpos contra Salmonella.
• Análisis molecular: PCR. Mediante un proceso de purificación se trata la suspensión con las colonias aisladas con el fin de obtener el DNA. El extracto se trata con solución amortiguadora, primers o cebadores, los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) y la DNA polimerasa o Taq-polimerasa y se introduce en un termociclador que permite amplificar la secuencia de interés. Un ejemplo es la amplificación de la región del gen InvA de Salmonella (Acosta, 2013)

Confirmación serológica de las colonias sospechosas

El análisis serológico permite identificar a nivel de especie. Para ello se depositan 3 gotas de suspensión microbiana de las colonias a analizar y se hacen reaccionar mezclándolas con suero polivalente O, H y utilizando la tercera como control. Finalmente se observa si aparece aglutinación obteniendo resultado positivo. En el caso de que exista aglutinación únicamente en el suero H, se añade al control antisuero Vi y se observa si se produce aglutinación.

Fuentes de transmisión

Salmonella es un agente productor de zoonosis de distribución universal (la segunda más declarada por detrás de Campylobacter con una tasa de 20.4 casos por cada 100.000 habitantes en 2011) (figura 9). Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, procesado de alimentos o agua de distribución.

Algunos serotipos presentan especificidad por el hospedador, por ejemplo las cepas de S. typhi y S. paratyphi están restringidas al ser humano, aunque algún serotipo de S. paratyphi puede infectar ocasionalmente ganado. Otros, como S. typhimurium y S. enteritidis, infectan a personas y animales, como aves, vacas, cerdos u ovejas. La bacteria vive en el tracto intestinal del hospedador infectado, por lo que, se transmite vía fecal-oral (WHO, 2011).

En las infecciones por serotipos no tifoideos los humanos actúan como vectores, o bien por el consumo de diversos alimentos contaminados y exposición a animales, mientras que para las especies tifoideas se asocia con el consumo de alimentos o agua contaminada, siendo poco frecuente la transmisión entre personas.

Salmonella es común en la piel de algunos reptiles y anfibios, lo cual puede ser un foco importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y alimentos. También pueden actuar las moscas como vector de Salmonella.

Vectores alimentarios

El pienso es uno de los factores de riesgo en la epidemiología de la salmonelosis, los animales pueden infectarse por las bacterias procedentes del ambiente contaminado de las granjas (estudios ambientales del MARM indicaron niveles en torno a un 12.5% en fábricas), pájaros o roedores, y también del pienso que se les suministra para alimentación (3.5%). (3tres3, 2012)

La Salmonella puede encontrarse en aves de corral, huevos (los huevos y ovoproductos representan la causa de la mitad de brotes de salmonelosis declarados a la EFSA, (AECOSAN, 2011)), carne de vacuno, así como en leche sin pasteurizar, pescado, frutas y vegetales crudos. También se puede contaminar a través del manipulado, como se indica en el apartado de fuentes de transmisión.

Si está presente en el alimento, por lo general, no se ven afectadas sus cualidades organolépticas.

Tiene cierta relevancia la presencia de este bacilo en agua de consumo, siendo más frecuente los casos debidos a S. typhimurium en aguas superficiales y subterráneas contaminadas.

Efectos sobre la salud

La salmonelosis se presenta a través de cuatro manifestaciones clínicas (Caffer et al., 2008):

• Gastroenteritis (diarrea, náuseas y vómitos)
• Bacteriemia o septicemia ( fiebre intermitente con hemocultivos positivos)
• Fiebre tifoidea o paratifoidea (fiebre continuada con o sin diarrea)
• Portador asintomático

Fiebre tifoidea-paratifoidea

Enfermedad de declaración obligatoria.

El serovar typhi produce la fiebre tifoidea, mientras que el paratyphi A, B, C producen fiebre paratifoidea (suele ser menos grave).

Se produce por la ingestión de alimentos o aguas contaminadas. Tras un periodo de incubación de 10-15 días se atraviesa la barrera intestinal y pasa a la sangre, donde es captado por los fagocitos de hígado, bazo y médula ósea, donde se multiplica. Más tarde se vuelve a producir una bacteriemia (de nuevo pasa a sangre. Una vez en el intestino actúa inflamando las placas Peyer, formando ulceras, hemorragias, perforación intestinal, peritonitis, pudiendo causar la muerte si no es tratada.

Salmonelosis

Todas las cepas pueden producir esta toxiinfección alimentaria excepto los serovares typhi, paratyphi A que producían fiebre tifoidea únicamente (S. paratyphi B puede producir salmonelosis y fiebre tifoidea).

Una vez se ingiere el alimento contaminado y tras 12 – 48 horas comienza la sintomatología náuseas, fiebre, dolor abdominal, diarrea, debilidad muscular, entre otras. Transcurridos 1-7 días cesan los síntomas.

Diagnóstico

Aunque existen pacientes que no presentan sintomatología, la mayoría de las personas experimentan:

• Diarrea
• Fiebre entre 8 y 72 horas después de la infección.
• Dolor abdominal

Otros síntomas que pueden darse son:

• Dolor de cabeza
• Náuseas, vómitos y pérdida de apetito
• Mialgia
• Erupción máculopapulosa en pecho y espalda (roséola tifoidea)
• Somnolencia

Estos síntomas suelen aparecer entre las 6 y 72 horas posteriores y desaparecen en un plazo de 4 a 7 días. La salmonelosis puede diagnosticarse mediante un cultivo bacteriano en muestra de heces. La mayoría de las personas mejora sin tratamiento, teniendo especial cuidado entre los grupos de riesgo (ancianos, niños pequeños y pacientes inmunodeprimidos) y en el caso de producirse una septicemia.

La fiebre tifoidea ocurre frecuentemente en países en vías de desarrollo. S. typhi se acumula en la vesícula biliar, formando una biopelícula sobre las piedras biliares, permitiendo su resistencia y adaptación en el entorno. El hospedador puede no presentar síntomas de enfermedad, pero elimina esta bacteria por las heces.

Profilaxis

Como en toda actividad agroalimentaria debe realizarse un enfoque completo sobre la inocuidad de las materias primas y los productos procesados, con el fin de reducir una toxiinfección producida por Salmonella.

Los granjeros, la industria, los inspectores, vendedores y trabajadores del sector, así como los consumidores, forman todos ellos un eslabón importante en la seguridad alimentaria mediante la aplicación de sistemas preventivos.

Los sistemas nacionales y regionales de vigilancia tienen un papel fundamental para detectar brotes de salmonelosis al inicio, evitando su propagación. (OMS 2013)

Materia prima

Se recomienda a los productores seguir un código de buenas prácticas de elaboración con el fin de prevenir la contaminación microbiana en productos frescos, entre las directrices se destaca el uso de residuos fecales tratados, la gestión del agua de uso, la utilización de piensos libres de microorganismos y el mantenimiento de las instalaciones y equipos, mejorando las condiciones higiénicas.

Siendo la industria avícola uno de los focos de diseminación de Salmonella, se recomienda tratar a los polluelos recién nacidos con antibióticos o bien, con probióticos que colonizan el intestino con microflora beneficiosa antes de que la salmonella invada al polluelo, siendo uno de los tratamientos preventivos más efectivo en recién nacidos. En aves adultas tratarlas con antibióticos.

Manipulado

Separar carnes y pescados de productos vegetales en el transporte y refrigeración,  utilizar utensilios de cocina diferentes así como evitar juntar alimentos cocinados y crudos para impedir que se produzca una contaminación cruzada.

Lavado de manos, superficies y utensilios alimentarios con agua caliente y jabón antes y después de trabajar con alimentos, así como después de usar el baño o estar en contacto con mascotas. Se ha demostrado que el alcohol es efectivo como agente desinfectante tópico, además del cloro. (Alba y Araujo, 2008)

Se recomienda el uso de papel desechable para la limpieza y el secado.

Una correcta educación en seguridad alimentaria y buenas prácticas de manipulación es fundamental para obtener alimentos sanos y seguros.

Cocinado:

La bacteria puede sobrevivir si los alimentos no son cocinados alcanzando una temperatura interna mínima adeuada:

• 62.8ºC para carne de vacuno, porcino o caprino ( 71.1ºC si procede de carne picada)
• 62.8ºC para el pescado
• 71.1ºC en huevos
• 73.9ºC para aves de corral.
• Sobras alimentarias recalentar hasta los 73.9ºC

Las frutas y verduras deben lavarse adecuadamente antes de procesarlas o consumirlas. La acidificación de los alimentos también ayuda a prevenir que se produzca una contaminación en cualquier etapa posterior.

La leche es pasteurizada industrialmente como método preventivo frente a microorganismos, debiendo evitarse la leche cruda o sus derivados.

Refrigerado

Los alimentos perecederos, preparados o sobras alimentarias deben mantenerse a una temperatura inferior a 4.5ºC.

Se puede congelar productos siempre que se alcance una temperatura por debajo de 18ºC y se descongelen en el refrigerador, con agua templada o en microondas (nunca a temperatura ambiente) antes de cocinarse siguiendo las recomendaciones del apartado anterior.

Tratamiento

En el cuadro gástrico, el tratamiento consiste en la rehidratación y reposición de electrolitos perdidos.

En grupos de riesgo e infecciones graves (septicemias) se recomienda terapia antimicrobiana. Actualmente debido a la resistencia de algunas cepas se recomienda el uso de fluoroquinolonas o cefalosporinas (WHO, 2005). En los casos más graves puede acompañarse del uso de esteroides e incluso la extirpación de la vesícula biliar.

[1] La presencia de cápsula depende del serovar en cuestión. Solo S. Typhi, S. Paratyphi C y S. Dublin presentan cápsula. (Comité científico de seguridad agroalimentaria de la CAE, 05/2008).